在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育，有人稱之為孵育。

　　溫育這一步是ELISA測定中容易出現問題的步驟。目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時間為37℃30分鐘-1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃1-2小時才能有較*的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。

　　1.溫育的時間選擇

　　ELISA屬固相測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

　　2.溫育的溫度選擇

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。

　　在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

　　3.溫育的保溫選擇

　　溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。

　　若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，*后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般采用鼓風恒溫箱保溫，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發。

　　無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。

　　室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證時間，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。