恩諾沙星
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物恩諾沙星藥物和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留恩諾沙星藥物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物恩諾沙星藥物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 1ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～15min
u 樣本檢測下限
恩諾沙星檢測下限 ···················· 1ppb
u 交叉反應率
恩諾沙星 ·························· 100%
u 樣本回收率
組織 /雞蛋 ··································· 80±15%
血 清 ······································ 80±15%
蜂 蜜 ······································ 75±15%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標準液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 1ppb |
3ppb | 9ppb | ||
27ppb | 81ppb | ||
3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250 ul
試 劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a） 本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。
（b） 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制：
配液1 0.1M HCL溶液：
860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。
配液2 乙腈-二氯甲烷混合溶液：
V乙腈：V二氯甲烷 = 1 : 4
配液3 pH7.2 0.02M PB緩沖液：
5.16g Na2HPO4·12H2O + 0.87g NaH2PO4·2H2O
加去離子水1L溶解。
配液4 乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液
100ml乙腈-二氯甲烷(V乙腈：V二氯甲烷 = 4 :1） 混合溶液中加入5ml 0.1M HCl溶液。
配液5 用去離子水將2X濃縮復溶液按1：1稀釋
（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本復溶。
（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）雞蛋
1、稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本于50ml離心管中；
2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、取4ml有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉蒸發(fā)至干；
4、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；
5、去除上層取下層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數：1
（b）血清樣本的處理
1、用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集雞血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；
2、加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；
3、移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；
4、加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發(fā)至干/氮氣吹干；
5、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；
6、輕吸掉上層和中間白色雜質，取下層相100µl加入100µl稀釋后的復溶液，混合30s；
7、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數：2
（c）蜂蜜樣本處理方法：
1、 取2.0±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液， 充分振蕩3min，15℃ 4000r/min以上離心10min；
2、 取2ml上清液于56℃氮氣或空氣流吹干；
3、 加入1ml的樣本復溶液，充分震蕩1min；
4、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數: 2倍
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
5、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
6、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
7、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
8、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行，并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。
9、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應30min。
10、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
11、 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
12、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含恩諾沙星藥物量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 1ppb為1.542；3ppb為1.130； 9ppb為0.635；27ppb為0.326； 81ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是27ppb - 81ppb；樣本2的濃度范圍是3ppb - 9ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中恩諾沙星藥物的實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以恩諾沙星標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中恩諾沙星藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
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