禽流感病毒（H5N1）抗體檢測試劑盒

介紹

禽流感病毒(H5N1)抗體檢測試劑盒檢測雞血清中的禽流感病毒H5N1抗體，用于評估養雞場雞禽流感疫苗免疫狀況及感染雞的血清學輔助診斷。

本試劑盒采用間接ELISA法，在酶標板微孔上預包被禽流感H5N1抗原。在試驗中，加入稀釋后的待檢血清，經過溫育后，若樣品中含有禽流感H5N1特異性抗體，則與包被板上的抗原結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后；加入酶標二抗，與檢測板上的抗原抗體復合物發生特異性結合；再經洗滌除去未結合的酶結合物；在微孔中加入TMB底物液，經酶催化形成藍色產物，加入終止液終止反應后，用酶標儀450nm波長測定反應孔中的吸光度A值。

需自備的設備及試劑

1.    微量移液器： 0.5µl～10µl、10µl～100µl、100µl～1000µl。

2.    一次性移液器吸頭。

3.    量筒：500ml。

4.    96孔板酶標儀。

5.    蒸餾水或去離子水。

6.    洗瓶或洗板機。

樣品制備

取動物全血，按常規方法制備血清，要求血清清亮，無溶血。

洗滌液的準備

濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫，如有鹽結晶，搖動使結晶的鹽溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。

樣品的稀釋

在血清稀釋板中按1：101的體積比稀釋待檢血清（例如：200μl樣品稀釋液中加2μl待檢血清）。

注意：陰性和陽性對照不用稀釋。取每個樣品后都要更換吸頭，準確記錄每個樣品在板上的位置。每個樣品在加入到包被板微孔前應充分混勻。

注意事項

1.    試劑盒使用前各試劑應平衡至室溫，使用前應搖勻，使用后放回2～8℃。

2.    不同品種、不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時應防止試劑污染。

3.    底物和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，使用時應該注意防護。

4.    TMB（底物B液）不要暴露于強光和避免接觸氧化劑。

5.    檢測板拆封后應避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2～8℃)。

6.    所有廢棄物在丟棄之前應合理處理以免污染。

7.    嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結果。操作過程中移液、定時和洗滌等的全部過程必須精確。

8.         血清稀釋板為一次性用品，不得重復使用；血清稀釋板的最大容量為300μl/孔。

操作步驟

1.    取預包被的檢測板（根據樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100μl加入到檢測板孔中。同時設陰性、陽性及空白對照各1孔，取陰性及陽性對照各100μl

分別加入反應孔中，空白對照僅加入100μl樣本稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出）。

2.    蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

3.    小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗3次。每次用洗滌液注滿板孔（約350μl），靜置1分鐘后甩掉。洗滌3次后在干凈吸水紙上拍干。

4.    每孔加酶結合物100μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

5.    小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌3次, 方法同2。切記最后在干凈吸水紙上拍干。

6.    每孔先加底物A液50µl、再加底物B液50µl，混勻、蓋上封板膜37℃閉光顯色10分鐘。

7.    每孔加終止液50μl，使反應終止，10分鐘內測定結果。

結果判定

以空白對照調零用酶標儀于450nm（630nm作參比波長）讀取吸光度A值。試驗成立的條件是陽性對照孔A450值大于或等于0.5，陰性對照孔A450值必須小于0.15。如果試驗無效，試驗中的操作值得懷疑，試驗應重做，并仔細檢察各組分。

樣品A450值大于0.15+陰性對照孔均值，判為陽性；樣品A450值小于0.15+陰性對照孔均值，判為陰性；如陰性對照孔均值小于0.05按0.05計算。

有效期

貯存方法： 2 - 8ºC下貯存。

有效期： 12個月。

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